Конфокальный микроскоп: принцип работы и когда он действительно нужен

Коротко: конфокальный микроскоп убирает свет из-за пределов фокуса с помощью точечной диафрагмы (пинхола) и получает оптические срезы образца, из которых собирается объёмное изображение. Он нужен для толстых образцов, трёхмерной реконструкции, колокализации и съёмки глубоко в ткани. Для тонких препаратов и простой флуоресценции обычно хватает широкопольного флуоресцентного микроскопа.

Как работает конфокальный микроскоп?

Конфокальный микроскоп освещает образец сфокусированным лазерным пятном и пропускает к детектору только свет из фокальной плоскости. Для этого перед детектором стоит точечная диафрагма, пинхол, в плоскости, сопряжённой с фокусом объектива. Свет от слоёв выше и ниже фокуса приходит на пинхол размытым пятном и почти целиком отсекается.

Так получается оптический срез - резкое изображение одного тонкого слоя без размытого фона соседних слоёв. Лазерное пятно обходит поле зрения точка за точкой, а затем микроскоп смещает фокус и снимает следующий срез. Из стопки срезов (z-стека) программа собирает объёмную модель клетки, ткани или поверхности.

Размер пинхола обычно выставляют около одного диска Эйри - это размер пятна, в которое объектив собирает свет от точки. Меньше пинхол - тоньше срез, но слабее сигнал; больше - ярче изображение, но толще срез и больше фона.

Чем конфокальный микроскоп лучше обычного флуоресцентного?

От широкопольного флуоресцентного микроскопа конфокал отличается прежде всего оптическим срезом. Широкопольный микроскоп освещает всю толщу образца сразу, и свет из-за фокуса ложится поверх изображения размытой дымкой. На тонком монослое клеток это почти незаметно, а на толстом срезе ткани или сфероиде дымка съедает детали.

Поэтому конфокал оправдан, когда задача трёхмерная: ткань, органоид, эмбрион, колокализация белков в объёме. Для плоских препаратов и подсчёта флуоресцентных клеток широкопольной системы обычно достаточно.

Какие бывают конфокальные системы?

Конфокальные системы делятся на четыре класса: с точечным лазерным сканированием, с вращающимся диском, многофотонные и лазерные конфокальные микроскопы для материалов. Первые три работают с флуоресценцией в биологии и медицине, четвёртый измеряет рельеф поверхности. Выбор определяет образец: живой или фиксированный, тонкий или толстый, биологический или технический.

Когда выбирать точечное сканирование?

Точечное лазерное сканирование выбирают, когда важны гибкость и чистота спектральных каналов: многоцветная съёмка фиксированных образцов, колокализация, спектральное разделение близких меток, произвольное увеличение и область сканирования. Скорость у классического гальванометрического сканера ниже, чем у систем с диском, но её добирают резонансным сканером.

У Olympus FV3000 спектральная детекция TruSpectral построена на объёмной фазовой голограмме и регулируемой щели: полосу каждого канала можно выбрать с шагом до 2 нм. Детекторы GaAsP повышают чувствительность к слабому сигналу.

В версии FV3000RS гибридный сканер объединяет точный гальванометрический и быстрый резонансный режимы. Резонансный даёт около 30 кадров в секунду и снижает выгорание красителей при съёмке живых клеток.

FV3000 собирают на инвертированном или прямом штативе под задачу лаборатории

Когда нужен вращающийся диск?

Конфокальный микроскоп с вращающимся диском нужен для долгой съёмки живых клеток, где важны скорость и щадящий режим. Вместо одной точки диск с тысячами пинхолов освещает образец множеством точек одновременно, поэтому кадр снимается камерой целиком, быстро и при меньшей мощности лазера на каждую точку.

В системе IXplore SpinSR от Evident стоит диск Yokogawa CSU-W1 с двумя дисками: с пинхолами 50 мкм для конфокальной съёмки и SoRa для сверхразрешения. Скорость достигает 200 кадров в секунду в полном кадре, а алгоритм TruSight SR повышает разрешение в плоскости XY до 120 нм.

Для долгого тайм-лапса важнее другое: микролинзы на диске собирают свет, поэтому лазер работает на меньшей мощности, а клетки меньше страдают от фототоксичности. Это позволяет снимать одну и ту же клетку часами и не терять сигнал из-за выгорания красителя.

Что даёт многофотонная микроскопия?

Многофотонный микроскоп нужен, когда снимать надо глубоко в ткани: в срезах мозга, органах, у живых животных. Флуорофор возбуждается двумя фотонами инфракрасного лазера одновременно, и это происходит только в точке фокуса. Инфракрасный свет меньше рассеивается в ткани, поэтому микроскоп заглядывает гораздо глубже обычного конфокального.

Olympus FVMPE-RS рассчитан на глубокую съёмку фиксированных образцов и живых животных: проникновение до 1-1,5 мм в зависимости от образца. Два инфракрасных лазера дают возбуждение в диапазоне 680-1300 нм для многоцветной съёмки, резонансное сканирование - до 438 кадров в секунду, детекторы GaAsP ловят слабый сигнал из глубины.

Чем полезен лазерный конфокальный микроскоп для материалов?

Лазерный конфокальный микроскоп для материалов измеряет рельеф поверхности без контакта: шероховатость, высоту ступеней, объём дефектов. Принцип тот же - пинхол отсекает свет вне фокуса. Но задача другая: по положению фокуса в каждой точке прибор строит трёхмерную карту высот, а флуоресценция не используется.

Olympus LEXT OLS5100 работает с лазером 405 нм и оптикой, рассчитанной под эту длину волны. Он измеряет шероховатость и линейно, как контактный профилометр, и по площади, различает ступени нанометрового диапазона, а латеральное разрешение достигает 0,12 мкм. Образец не нужно готовить: его кладут на столик и измеряют.

OLS5100 измеряет шероховатость без контакта с поверхностью

Какие объективы и лазеры нужны конфокалу?

Набор лазеров подбирают под метки, с которыми работает лаборатория, а объективы - под толщину и тип образца. Типичная четвёрка линий 405, 488, 561 и 640 нм закрывает самые распространённые красители: DAPI, GFP и FITC, RFP и mCherry, Cy5 и близкие к нему. Редкие метки требуют отдельной проверки.

Объективы для конфокала берут с высокой числовой апертурой: от неё зависят яркость и толщина оптического среза. Для глубокой съёмки живых образцов у Evident есть силиконовые иммерсионные объективы: показатель преломления силиконового масла ближе к живой ткани, чем у обычного иммерсионного масла, и изображение меньше портится с глубиной.

Частая ошибка - покупать конфокальную систему под задачу, которую решает широкопольный микроскоп: подсчёт клеток или иммунофлуоресценцию на монослое. Бюджет уходит в лазеры и сканер, а для плоских препаратов камера на широкопольном штативе снимает быстрее.

Когда конфокальный микроскоп не нужен?

Конфокал обычно не нужен, если образцы тонкие, а задача двумерная: подсчёт клеток, флуоресцентная диагностика мазков, простая иммунофлуоресценция на монослое. Здесь широкопольный флуоресцентный микроскоп с хорошей камерой даёт похожую картинку дешевле и быстрее, а для образцов средней толщины бывает достаточно деконволюции - вычислительного удаления размытия.

Для очень крупных просветлённых образцов вроде целых органов есть отдельный класс - микроскопы плоскостного освещения. В каталоге это Olympus Alpha3. Если конфокал всё же нужен, до покупки проверьте инфраструктуру:

1. Помещение - стабильная температура, защита от вибраций, место под лазеры и компьютер.
2. Образцы - какие метки и длины волн, отсюда набор лазеров и фильтров.
3. Живые клетки - инкубационная камера и удержание фокуса на штативе.
4. Данные - хранилище и компьютер для z-стеков и тайм-лапсов.
5. Люди - оператор, которого нужно обучить работе с системой.

Для живых клеток штатив обычно инвертированный: об этом подробнее в статье об инвертированных микроскопах.

Частые вопросы

В чём принцип работы конфокального микроскопа?

Лазер фокусируется в точку образца, а точечная диафрагма перед детектором пропускает только свет из фокальной плоскости. Сканирование по полю и по глубине даёт стопку оптических срезов и объёмное изображение.

Чем конфокальный микроскоп отличается от флуоресцентного?

Широкопольный флуоресцентный микроскоп собирает свет со всей толщины образца, конфокальный отсекает свет из-за фокуса. Поэтому конфокальный даёт оптические срезы и 3D, особенно на толстых образцах.

Что лучше для живых клеток: точечное сканирование или диск?

Для долгой съёмки живых клеток обычно выбирают вращающийся диск: он быстрее и мягче к образцу. Точечное сканирование сильнее в спектральной гибкости и работе с фиксированными образцами.

Какое разрешение у конфокального микроскопа?

Разрешение ограничено оптикой, а главное преимущество конфокала - оптические срезы. Системы сверхразрешения на вращающемся диске, например IXplore SpinSR, доходят до 120 нм в плоскости XY.

Нужен ли конфокальный микроскоп для измерения шероховатости?

Для бесконтактного измерения рельефа используют лазерные конфокальные микроскопы для материалов, например Olympus LEXT OLS5100 с лазером 405 нм и латеральным разрешением 0,12 мкм.

Подберём конфокальную систему и комплектацию под ваши образцы: звоните +7 (909) 963-20-62 или пишите на info@mikroptika.ru.