Инвертированный микроскоп: что это, для каких задач и как выбрать

Коротко: у инвертированного микроскопа объективы стоят под предметным столиком и смотрят на образец снизу, а осветитель с конденсором вынесены наверх. Такая схема нужна, чтобы наблюдать живые клетки прямо во флаконах, чашках и планшетах, работать микроманипуляторами и изучать металлические шлифы. Для ежедневного осмотра культур хватает компактной модели с фазовым контрастом, для флуоресцентной съёмки живых клеток нужен исследовательский штатив.

Что такое инвертированный микроскоп и чем он отличается от прямого?

Инвертированный микроскоп - световой микроскоп с перевёрнутой схемой: револьвер с объективами находится под столиком, а источник света и конденсор - над образцом. Клетки оседают на дно сосуда, и объектив видит их сквозь это дно с минимального расстояния. Слой питательной среды над клетками при этом наблюдению не мешает.

У прямого микроскопа всё наоборот: объектив сверху, образец - тонкий препарат на предметном стекле под покровным. Прямой штатив удобен для мазков и срезов. Флакон с культурой высотой в несколько сантиметров под него просто не встанет.

Для каких задач нужен инвертированный микроскоп?

Инвертированный микроскоп берут, когда образец нельзя или неудобно класть на предметное стекло. Это живые культуры клеток во флаконах и планшетах, ооциты и эмбрионы в чашках при ЭКО, крупные металлические образцы. Во всех случаях работает одно преимущество: объектив подходит к образцу снизу, а пространство сверху остаётся свободным для рук и инструментов.

• Контроль культур клеток. Перед пересевом смотрят плотность монослоя, форму клеток и признаки контаминации, не открывая флакон.
• Микроманипуляции. ICSI, микроинъекции и работа с отдельными клетками: иглы и держатели заводят сверху. Для этого в каталоге есть готовое решение Olympus IX3-ICSI/IMSI.
• Съёмка живых клеток. Флуоресценция и многочасовой тайм-лапс в инкубационной камере прямо на столике.
• Металлография. Шлиф кладут полированной стороной вниз, и его поверхность сама оказывается в фокальной плоскости.

Конденсор CKX53 с рабочим расстоянием 72 мм пропускает сосуды высотой до 190 мм

Какие методы контраста нужны для живых клеток?

Живые клетки почти прозрачны, и в светлом поле их едва видно. Поэтому базовый метод для культур - фазовый контраст: он превращает разницу оптической толщины клетки и среды в разницу яркости. Для объёмного рельефа добавляют модуляционный контраст, для клеток с метками вроде GFP - флуоресценцию. Дифференциально-интерференционный контраст (ДИК) требует особого подхода к пластику.

Модуляционный контраст у разных производителей называется по-своему: у Evident - рельефный контраст (RC), у Leica - IMC, у Zeiss - iHMC. У Leica DM IL LED модуляционный контраст работает без специальных объективов на увеличениях 10x, 20x, 32x и 40x. У Olympus CKX53 кроме фазового контраста есть собственный метод, инверсионный контраст (IVC).

Классический ДИК на пластиковых чашках и планшетах даёт мутную картинку: пластик двулучепреломляет и сбивает поляризацию. Для ДИК берут чашки со стеклянным дном или систему с PlasDIC - вариантом ДИК от Zeiss для пластиковых сосудов, он есть у Axio Vert.A1.

Какой класс инвертированного микроскопа вам нужен?

Инвертированные микроскопы делятся на три класса: компактные рутинные для ежедневного осмотра культур, продвинутые рутинные с набором методов контраста и модульные исследовательские штативы для флуоресценции и автоматизации. Класс определяет не только бюджет, но и то, какие модули получится добавить через год, когда задачи лаборатории вырастут.

Компактные модели различаются деталями. Zeiss Primovert рассчитан на установку в ламинарный бокс, версия iLED добавляет флуоресценцию для GFP, а Primovert digital - встроенную камеру и приложение Labscope для iPad. Olympus CKX53 весит около 6,9 кг, а с дополнительным держателем на его столик помещаются сразу три чашки диаметром 35 мм.

В исследовательском классе решает модульность. У Olympus (Evident) IX73 в исполнении IX73P2F два яруса для модулей: промежуточной лупы, кассет флуоресцентных фильтров. Открытый столик рассчитан на микроманипуляторы, поэтому Evident предлагает IX73 и для ICSI. Olympus IX83 полностью моторизован, а система TruFocus держит фокус при многочасовой съёмке: ближний инфракрасный лазер находит границу дна сосуда и образца и компенсирует дрейф.

IX73 собирают под задачу: ярусы для модулей, камеры, флуоресцентные осветители

Какие объективы и конденсор нужны для флаконов и планшетов?

Для работы через дно сосуда нужны объективы и конденсор с большим рабочим расстоянием. Обычные объективы прямого микроскопа рассчитаны на покровное стекло толщиной 0,17 мм. Через заметно более толстое пластиковое дно флакона на увеличениях 20x-40x они дают размытую картинку, а короткий конденсор не даст поставить высокий флакон.

Конденсор определяет, какой сосуд вообще встанет на столик. У Olympus CKX53 встроенный конденсор с апертурой 0,3 и рабочим расстоянием 72 мм. Для высоких флаконов этот параметр проверяют первым, раньше увеличения.

Объективы для культур маркируют LWD (long working distance) или похожими индексами у разных брендов. На 20x и 40x их делают с кольцом коррекции: кольцо поворачивают под толщину дна конкретного сосуда. Например, у объектива Evident LUCPLFLN 40x с апертурой 0,60 рабочее расстояние в зависимости от положения кольца составляет 2,7-4,0 мм.

Перед заказом выпишите сосуды, с которыми работаете: флаконы T-25 и T-75, чашки 35 и 60 мм, 96-луночные планшеты. По этому списку подбирают держатели столика, рабочее расстояние конденсора и набор объективов.

Что проверить в комплектации перед покупкой?

Комплектацию инвертированного микроскопа проверяют по шести пунктам: сосуды и держатели, методы контраста, объективы, документирование, место установки и возможность расширения. Если хотя бы один пункт не закрыт, микроскоп придётся дооснащать уже после покупки, а часть задач до этого момента будет стоять.

1. Сосуды и держатели. Какие флаконы, чашки и планшеты, какой максимальной высоты.
2. Методы контраста. Фазовый контраст для всех рабочих объективов, модуляционный контраст или ДИК для рельефа, флуоресценция при наличии меток.
3. Объективы. Увеличения, исполнение LWD, кольцо коррекции на 20x и 40x.
4. Документирование. Тринокулярная насадка или порт камеры, совместимость камеры с вашей программой анализа.
5. Место установки. Габариты под ламинарный бокс или рядом с инкубатором, устойчивый стол без вибраций.
6. Расширение. Можно ли позже добавить флуоресценцию, моторизованный столик или инкубационную камеру.

Частая ошибка - брать исследовательский штатив «на вырост» для ежедневного осмотра флаконов. Деньги уходят в модульность, которой лаборатория не пользуется. Рутину спокойно закрывает компактная модель. Обратная ошибка - экономить на классе, когда через полгода нужен тайм-лапс: компактный штатив до исследовательского не дооснастить.

Чем инвертированный микроскоп удобен в металлографии?

В металлографии инвертированный штатив ценят за то, что шлиф кладут полированной стороной вниз прямо на столик. Поверхность шлифа сама совпадает с фокальной плоскостью, поэтому образец не нужно выравнивать. Высокая заготовка тоже не упирается в объектив. Это ускоряет смену образцов при серийном контроле.

В каталоге так устроен Olympus GX53 - металлографический инвертированный микроскоп для анализа микроструктуры в отражённом свете. Для материаловедения выпускают и исполнения универсальных штативов, например Zeiss Axio Vert.A1 MAT.

Шлиф на GX53 лежит полированной стороной вниз, выравнивать его не нужно

Какой инвертированный микроскоп взять под типовые задачи?

Типовой выбор выглядит так: культуральной лаборатории для ежедневного контроля хватает компактной модели с фазовым контрастом, ЭКО и микроманипуляциям нужен продвинутый штатив с модуляционным контрастом, а съёмке живых клеток - исследовательская система. Точную комплектацию подбирают по сосудам, методам контраста и числу людей, которые работают на микроскопе каждый день.

Если задача пограничная, например пересев плюс редкая флуоресцентная съёмка, начните с компактной модели с флуоресцентной опцией. Про общие критерии выбора микроскопа мы писали в статье «Как выбрать микроскоп?».

Частые вопросы

Можно ли смотреть обычные мазки на инвертированном микроскопе?

Можно: предметное стекло кладут покровным стеклом вниз. Для потока мазков и срезов удобнее прямой микроскоп - у него больше выбор объективов под покровное стекло и конденсоров с высокой апертурой.

Какое увеличение нужно для работы с культурами клеток?

Для ежедневного осмотра хватает объективов 4x, 10x и 20x. Объектив 40x с кольцом коррекции берут для деталей морфологии и флуоресцентной съёмки.

Почему ДИК не работает на пластиковых чашках?

Пластик двулучепреломляет свет и сбивает поляризацию, на которой построен ДИК. Решения: чашки со стеклянным дном, модуляционный контраст или PlasDIC у Zeiss.

Можно ли подключить камеру к инвертированному микроскопу?

Да, у большинства моделей есть тринокулярная насадка или боковой порт. У Zeiss Primovert есть версия digital со встроенной камерой и приложением для iPad.

Чем исследовательский инвертированный микроскоп отличается от рутинного?

Модульностью и моторизацией: к исследовательскому штативу добавляют флуоресцентные модули, моторизованный столик, удержание фокуса и инкубационную камеру. Рутинная модель закрывает осмотр и простую съёмку.

Подберём инвертированный микроскоп и комплектацию под ваши сосуды и методы контраста: звоните +7 (909) 963-20-62 или пишите на info@mikroptika.ru.